博蕾德實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)指南

Western Blot 實(shí)驗(yàn)服務(wù)檢測

樣品處理及保存

1）懸浮細(xì)胞樣品：

 把細(xì)胞及培養(yǎng)液一起收集到15ml或者50ml離心管中，1500rpm離心3min，棄去上清；加入PBS輕輕吹打，1500rpm離心3min，棄去上清；反復(fù)3次，棄去上清后于-80度或者液氮凍存待用。在避免凍融的情況一般保存1年，建議盡快檢測。

2）貼壁細(xì)胞樣品

• 胰酶消化：用胰酶將細(xì)胞消化后，收集到15ml或者50ml離心管中，1500rpm離心3min，棄去上清；加入PBS輕輕吹打，1500rpm離心3min，棄去上清；反復(fù)3次，棄去上清后于-80度或者液氮凍存待用。在避免凍融的情況一般保存1年，建議盡快檢測。
• 細(xì)胞刮子收集細(xì)胞：對(duì)于某些蛋白（即對(duì)胰酶比較敏感或者實(shí)驗(yàn)特殊要求，如E-Cadherin不易用胰酶消化后進(jìn)行WB檢測），直接用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，收集到EP、15ml或者50ml離心管中，1500rpm離心3min，棄去上清；加入PBS輕輕吹打，1500rpm離心3min，棄去上清；反復(fù)3次，棄去上清后于-80度或者液氮凍存待用。在避免凍融的情況一般保存1年，建議盡快檢測。

3）動(dòng)物組織樣品：

    取下合適的動(dòng)物或者人的組織樣品后用預(yù)冷的PBS或者生理鹽水漂洗，盡量除盡殘留血液，用濾紙把多余PBS吸取干凈。把組織分成約50mg大?。ㄒ罁?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枰M(jìn)行調(diào)整），用錫紙分別包裝好或者用凍存管裝好，于-80度或者液氮中保存。在避免凍融的情況一般保存1年，建議盡快檢測。

4）植物樣品：

    取得待測植物樣品后，用蒸餾水把泥土漂洗干凈，用濾紙把多余水分吸取干凈，分裝成合適大小于-80度或者液氮中保存。在避免凍融的情況一般保存1年，建議盡快檢測。

5）細(xì)菌樣品：

細(xì)菌培養(yǎng)完成后，10000rpm離心5min收集細(xì)菌，加入PBS吹打，10000rpm離心5min，棄去上清；反復(fù)3次，棄去上清后于-80度或者液氮凍存待用。

客戶提供資料

• 新鮮或正確保存的樣品：細(xì)胞＞1×10⁷；組織＞30mg；細(xì)菌濕重＞1mg；植物＞100mg；血清＞50ul等；樣品蛋白濃度＞1mg/ml，蛋白量＞200ug/樣品。
• 若要檢測磷酸化蛋白，請(qǐng)?jiān)?/span>3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行。長時(shí)間保存樣品容易使磷酸化蛋白去磷酸化而檢測不到磷酸化條帶。
• 提取胞漿、胞核蛋白的樣品應(yīng)盡量采用新鮮樣品，凍存樣品提取的胞核蛋白可能會(huì)減少。
• 目的蛋白一抗，我公司可代購。
• 陽性對(duì)照樣品（盡量提供）；

結(jié)果提供

• 預(yù)實(shí)驗(yàn)曝光結(jié)果（膠片及掃描圖），預(yù)實(shí)驗(yàn)采取一至兩個(gè)一抗稀釋度；
• 正式實(shí)驗(yàn)曝光結(jié)果（膠片及掃描圖）；
• 完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告；
• OD值分析報(bào)告（可選）。

收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)

以每張膜8個(gè)樣本收費(fèi)，不足8個(gè)樣本按8個(gè)樣本收費(fèi)，歡迎詢價(jià)詳談。

ELISA 實(shí)驗(yàn)服務(wù)檢測

樣品處理及保存
 1）血清：
     室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
 2）血漿：
    應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
 3）尿液：
    用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。
 4）細(xì)胞培養(yǎng)上清：
    A、檢測分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/ 分）。仔細(xì)收集上清。
    B、檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并 放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
  5）組織標(biāo)本：
    切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的細(xì)胞/組織裂解液，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

客戶提供資料

• 提供液體類標(biāo)本（血清、血漿、尿液、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等）和組織標(biāo)本。（注：當(dāng)天收集待檢測的標(biāo)本，儲(chǔ)存于4℃；周期收集樣本待檢測的標(biāo)本，保存于-70℃，避免反復(fù)凍融）。
• ELISA 試劑盒

結(jié)果提供

詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程（包括標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品的吸光值、濃度等），保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確、客觀、可信，但不能確保一定要得到某特定結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)費(fèi)用及時(shí)間：

根據(jù)樣品數(shù)目進(jìn)行報(bào)價(jià)（具體事宜請(qǐng)咨詢）。ELISA實(shí)驗(yàn)一般3-5個(gè)工作日。

流式細(xì)胞術(shù)檢測服務(wù)

樣品制備參考：

A.     直接標(biāo)記抗體（FITC標(biāo)記抗體）：
(1) 收集1×10⁶個(gè)細(xì)胞，800rpm離心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
(2) 用4%多聚甲醛1ml室溫固定40分鐘，800rpm離心5min去上清。加2ml PBS重懸洗滌細(xì)胞，800rpm離心5min。
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重懸細(xì)胞，冰上孵育10min，800rpm離心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和飽和劑量的熒光標(biāo)記抗體(5×10⁵個(gè)細(xì)胞/20ul抗體)的PBS ,避光冰上放置30min,離心棄上清。加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待測即可。
(4) 用流式細(xì)胞儀檢測熒光值,每管計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。

B.     未標(biāo)記抗體間接免疫熒光標(biāo)記法：
(1) 收集2×10⁶個(gè)細(xì)胞，用冷的PBS 2ml 洗滌細(xì)胞一次，800rpm離心5min。
(2) 用2ml 4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞40min,800rpm離心5min；2ml PBS重懸細(xì)胞，800rpm離心5min；
(3) 用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重懸細(xì)胞，冰上放置10min,800rpm離心5min。
(4) 加入飽和劑量未標(biāo)記抗體，冰上放置40min,800rpm離心5min，用2ml冷的PBS 重懸細(xì)胞，800rpm離心5min，洗去未結(jié)合一抗，重復(fù)一次。
(5) 加入熒光標(biāo)記（FITC）標(biāo)記的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm離心5min，去上清，PBS洗滌兩次。
(6) 加入0.5ml 1%多聚甲醛重懸細(xì)胞；固定待測。
(7) 流式細(xì)胞儀檢測熒光值,每管計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。
C.細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及DNA倍體分析樣品（PI染色）的制備：
(1) 待測樣本制成單細(xì)胞懸液，然后2000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清。
(2) 用4℃預(yù)冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小時(shí)。
(3) 調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁶細(xì)胞/毫升，取1毫升細(xì)胞懸液，用PBS洗三次，細(xì)胞重懸于1毫升PI染液中，37℃孵育30分鐘即可進(jìn)行流式分析。
(4) PI染液終濃度為50微克/毫升，RNase A終濃度為20微克/毫升。
注：本方法僅供參考，如有其它要求，請(qǐng)?jiān)谒蜆忧罢f明

客戶提供：
1) 單個(gè)細(xì)胞：1~2×10⁶ 個(gè)細(xì)胞左右；來源于人、小鼠、大鼠或其它。

2）外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右；來源于人、小鼠、大鼠或其它

3）抗體（熒光素標(biāo)記）或檢測試劑盒

結(jié)果提供：

l實(shí)驗(yàn)方法、步驟、所用試劑、儀器等。

流式實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)費(fèi)用及時(shí)間：

根據(jù)樣品數(shù)目和檢測項(xiàng)目進(jìn)行報(bào)價(jià)（具體事宜請(qǐng)咨詢）。流式實(shí)驗(yàn)一般為3-5個(gè)工作日。