ELISA原理，以及操作步聚

 

ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定（ Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ）的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。

 

ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法（圖a）、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法（圖b）以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

 

　　（二）　操作步驟

　　方法一　用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:

　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。

　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔）。

　　3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

　　4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

　　5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。

　　方法二　用于檢測(cè)未知抗體的間接法：

　　　　　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
　　　　　　每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔
　　　　　　中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。（同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對(duì)照）

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，
　　　　　　37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。

　　　　　　　　　　　　　　↓

其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

 

　　（三）　試劑器材

　　1.　試劑

　　（1）　包被緩沖液（PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液）:

　　　　　　NaHCO３   1.59克

　　　　　　NaHCO３　 2.93克

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　（2）　洗滌緩沖液（PH7.4 PBS）：0.15M

　　　　　　KH₂PO₄ 　　　　　0.2克

　　　　　　Na₂HPO_４·12H₂O　　2.9克

　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克

　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克

　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　（3）　稀釋液：

　　　　　　　牛血清白蛋白（BSA） 0.1克

　　　　　　　加洗滌緩沖液至100ml

　　　　或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用。

　　（4）　終止液（2M　H２SO４）：

　　　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。

　　（5）　底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:

　　　　0.2M Na２HPO４（28.4克／L） 25.7ml

　　　　0.1M 檸檬酸（19.2克／L）　　　　　 24.3ml

　　　　加蒸餾水50ml。

　　（6）　TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:

　　　　TMB（10mg／5ml無水乙醇） 0.5ml

　　　　底物緩沖液（PH5.5）　　　 10ml

　　　　0.75％H２O２　　 　32μl

　　（7）　ABTS使用液:

　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg

　　　　底物緩沖液（PH5.5）　 1ml

　　　　3％H２O２　 　2μl

　　（8）　抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

　　（9）　正常人血清和陽性對(duì)照血清。

　　2.　器材:

　　（1）　聚苯乙烯塑料板（簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板）40孔或96孔，ELISA檢測(cè)儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

　　（2）　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。

 

　　1.　正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

　　2.　在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:

　　（1）　固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

　　（2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg／ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值z(mì)ui大而蛋白量zui少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。

　　（3）　酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

　　（4）　酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H₂O₂在臨用前加入。